Zinkfinger-nuklease

Zinkfinger nuclease kunstige restriktionsenzymer er skabt ud fra fusionsdomænet zinkfinger-DNA-bindende domæne af en DNA-pause.

Zinkfingre kan modificeres til at genkende specifikke DNA-sekvenser, der tillader zinkfinger-nuklease proces unikke sekvenser i en hel-genom. Maskiner fordel af endogen DNA-reparation, kan anvende disse reagenser til at modificere genomet af højere organismer. Denne funktion gør dem et værdifuldt værktøj til molekylær kirurgi, som indebærer at vende sygdomsfremkaldende mutationer. Du kan ændre formen zinkfingre der genkender en specifik sekvens tæt på sygdomsfremkaldende mutation, og indtast en vild sekvens uden mutation i cellen. Den korte nuklease i begge strenge af DNA og anvendt som template for vildtypesekvensen for cellulær reparation ved homolog rekombination. Fordelene ved at anvende zinkfinger-nuklease til dette formål reparerer gensekvensen uden nogen sekvens integreres i genomet, effektiviteten er meget høj, og det er ikke nødvendigt at opretholde ekspressionen af ​​et gen over tid. Men de har også ulemper, da de sandsynligvis kun kan anvendes på ex vivo-terapier er meget immunogen og producere bivirkninger, fordi det stadig skal vise sin sikkerhed.

DNA nukleasedomænet

En af de domæner af uspecifik DNA bryde flere ZFNs anvendes i restriktionsenzym er type IIs Fokl. Dette domæne skal dimerisere at fragmentere DNA'et, og derfor et par ZFNs er nødvendigt at anerkende ikke-palindromiske DNA sites. Standard ZFNs den nukleasedomænet fusioneret ved C-terminale domæne af hvert zinkfinger. For de to domæner kan dimeriserer brud og bryde DNA'et skal vedlægges den modsatte streng af DNA med dets C-terminal til en bestemt afstand. Linkersekvensen mellem de to domæner kræver, at 5'-enden af ​​hvert bindingssted er adskilt mellem 5 og 7 basepar.

Forskellige teknikker er blevet anvendt i protein engineering at forbedre aktiviteten og specificiteten af ​​nukleasedomænet bundet zinkfingre. For eksempel er det blevet tyet til målrettet evolution at generere en variant med forbedret Fokl nukleaseaktivitet, kaldet "Sharkey". Er også blevet anvendt baseret på strukturen for at forbedre specifikke aktivitet af Fokl dimerisering zone ændring af designet.

DNA-bindende domæne

DNA-bindingsdomænet af zinkfingre normalt indeholde fra tre til seks zinkfingre og hver gentagen kendt mellem 8 og 18 basepar. Hvis zinkfingre er sekvensspecifik, derefter et par ZFNs tre fingre, som genkender i alt 18 basepar kan teoretisk genkende en enkelt locus i et pattedyr genom. Forskellige strategier er blevet udviklet til engineering zinkfinger så Cys2His2 slutte sig til de ønskede sekvenser. Disse omfatter de modulære montage og selektionsstrategier beskæftiger fagdisplay eller celle sortering systemer er inkluderet.

Næste artikel Zoey Deutch